Northern blotting 試劑盒（含地高辛探針）
一、試劑盒組成：
（1） 地高辛標記的目的探針 25T
（2） 樣品預處理液
（3） 甲醛變性電泳上樣緩沖液
（4） 10XMOPS溶液、洗滌膠溶液、RNA水解液
（5） 轉(zhuǎn)膜液
（6） 雜交液
（7） 洗滌液I、洗滌液II
（8） NBT/BCIP顯色底物
（9） NBT/BCIP顯色緩沖液
試劑盒：25T
保存：2-8℃
貨號：R2550
二、核酸樣本準備與電泳：
Northern blotting是檢測單一基因RNA表達變化首選方法，核酸電泳是變性條件下進行以除RNA二級結(jié)構(gòu)。本試劑盒主要通過甲醛變性。然后將RNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜，再與地高辛探針雜交。
三、探針的獲得：
Northern探針可以用PCR標記，隨機引物標記，T7/SP6轉(zhuǎn)錄特異性RNA標記，末端轉(zhuǎn)移酶法，DIG寡核苷酸末端標記，缺口翻譯進行DIG標記，cDNA合成，外顯子生物均可提供上述地高辛探針標記（約2000元，至少滿足20次）。使用探針濃度約10-15ng/ml，探針長度變大，導致使用量變大。本試劑盒提供的探針是客戶定制的地高辛標記RNA探針。
四、結(jié)果顯色說明：
可以采用堿性磷酸酶底物NBT和BCIP，抗-地高辛過氧化物酶與NBT/BCIP反應。用于X底片顯色。也可以選擇其他顯色方法。
五、實驗操作步驟：
（1）RNA電泳樣品準備：為防止RNA降解，請在冰上操作，10-20ug（2-4ul）的RNA與樣品預處理液1:8體積混合，加熱85℃10分鐘，加入2ul甲醛變性電泳上樣緩沖液混合，冰上待用。
（2）配膠：1.5%的瓊脂糖可以分離0.5kb-1.5kb左右片段。稱量1.5g瓊脂糖加80ml純水，煮沸，冷卻到55℃左右（不燙手），加入10ml 10XMOPS和20ml去離子甲醛溶液，室溫放置1小時。
（3）在5V/cm電壓下，預電泳5分鐘，加入樣品和RNA Marker，電泳需要至少4小時，每隔1小時更換1X MOPS電泳緩沖液一次。
（4）將瓊脂糖膠放在保鮮膜內(nèi)，紫外燈下計算作圖并標記，評估分子量的位置。
（5）在室溫下將凝膠浸入洗滌膠溶液中20分鐘，輕輕搖動。用RNA水解液浸泡凝膠20分鐘，立即轉(zhuǎn)膜。
（5）轉(zhuǎn)模：按照下圖制作轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，利用試劑盒提供的轉(zhuǎn)膜液通過毛細管轉(zhuǎn)移到膜上，從凝膠吸取RNA到尼龍膜過夜，以確保RNA有效轉(zhuǎn)移。
轉(zhuǎn)模圖（略）
（6）轉(zhuǎn)模后，使用 UV交聯(lián)濕膜，無需清洗。UV交聯(lián)后，用H2O短暫沖洗膜，然后使其風干�；蛟�120°C下烘烤，30分鐘。可以用亞甲藍溶液鑒定RNA的豐度。
（7）預雜交和雜交：將印跡膜放在包含20 ml預雜交溶液的雜交袋中，密封袋子，預雜交溫度下預雜交2小時。探針濃度：10–20ng/ml，DIG標記探針，雙鏈DNA探針，在沸水浴中加熱10分鐘使DNA變性，在冰上冷卻。單鏈RNA探針和寡核苷酸探針在稀釋前不需變性。準備至少3.5 ml雜交溶液，以滿足10x10 cm的印跡。用雜交溶液稀釋探針。丟棄袋子內(nèi)預雜交溶液，添加包含DIG標記探針的雜交溶液。42℃條件下均勻搖動雜交15-18小時。
（8）洗滌：在室溫下，將膜在洗滌液I中洗滌兩次，每次5分鐘，除去未結(jié)合的探針。在洗滌液II中清洗膜兩次，每次清洗15分鐘。
（9）雜交后洗滌，將膜在洗滌液I中平衡1分鐘。在封閉溶液中輕輕攪動薄膜30-60分鐘，封閉薄膜。
（10）地高辛二抗孵育：稀釋抗高辛抗體，將3 µl Anti-Digoxigenin-AP添加到30 ml封閉液中并混合。在抗體溶液中將膜孵育30分鐘。棄抗體溶液，在洗滌液I中輕輕洗膜兩次，每次洗滌15分鐘。
（10）曝光檢測信號：棄洗滌液，在NBT/BCIP緩沖液中平衡膜2分鐘。配置NBT/BCIP顯色液，常規(guī)方法顯色，NBT/BCIP一般2分鐘-12小時內(nèi)。
