1. Xist探針準備

（1）在 Xist 序列獲得寡核苷酸探針（20-40 核苷酸長度的寡核苷酸，Tm=63-65ºC，標記多個地高辛或熒光素），探針最終濃度約為12-25μM。亦可聯(lián)系我們制備和購買探針，贈送內參。

（2）用雜交液將熒光或地高辛標記的探針稀釋至終濃度為 250 nM 。雜交液配制：10%去離子甲酰胺，300mM NaCl；30mM檸檬酸鈉；1mg/ml牛血清白蛋白；10% DSS。亦可聯(lián)系我們購買。

2.制備石蠟組織切片或培養(yǎng)細胞：

石蠟組織切片：詳見石蠟組織切片mRNA原位雜交，類似于普通免疫組化切片。培養(yǎng)細胞：移去 6 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基。用 PBS清洗，吸出，在培養(yǎng)皿中加入 0.5ml 胰蛋白酶，孵育5-10分鐘。加入5 ml 培養(yǎng)基，打數(shù)分散細胞。將細胞轉移到 10ml 管中，在室溫下以 1500 rpm 離心5 分鐘。棄去培養(yǎng)基，懸浮細胞于1-2 ml PBS中，細胞備用，福爾馬林或無水乙醇固定10分鐘。用細胞對切片進行涂片或用設備甩片，37℃晾干，過夜。

3. 免疫熒光

（1）將載玻片放入裝有 PBSTT（1x PBS 含 0.1% Tween-20，0.1% Triton-100）的染色盒或染色缸內中10分鐘。（2） 將載玻片傾斜放置，移去液體，滴加100 μl 封閉溶液（1x PBS、1% BSA、0.1% Tween-20），覆蓋玻片，在室溫下孵育 10 分鐘。（3）取下蓋玻片，倒去封閉液，加入 40-100μl 稀釋抗體（濃度為 1:500， 熒光抗體），注意避光。蓋好蓋玻片，室溫避光孵育30分鐘。

3. 原位雜交

（1）將載玻片傾斜，抗體緩沖液順玻片流下。在載玻片上加入 500 μl FISH 洗滌緩沖液（2x SSC+10% 甲酰胺），室溫孵育5分鐘。

（2）傾斜玻片，去除 FISH 洗滌液，載玻片上加入20μl 寡核苷酸探針，蓋上蓋玻片，然后將載玻片轉移到預熱的濕盒內；在37°C孵育 2-24 小時。

（3）玻片盒內加入 FISH 洗滌液，將洗滌液預熱（如37°C水浴），FISH 洗滌緩沖液。載玻片孵育5分鐘，期間，蓋玻片從載玻片上脫落。

（4）更換洗滌液，將載玻片洗滌緩沖液中繼續(xù)孵育 5 分鐘。

（5）將載玻片滴加 0.5 ng/ml 含抗淬滅劑DAPI溶液（我公司有售）。

（6）用指甲油或甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。4°C避光中保存幾個月。

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